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近年來發展起來的1H—1H和1H—13C COSY等二維核磁共振譜已應用在靈芝三 結构的測定中。
5.旋光光譜﹕旋光光譜主要是解決絕對构型問題，從文獻報道的CD譜數据總結出CD譜与絕對构型關系﹔凡是具有[I]式絕對构型者，C7為羥基，不管3位或15位是羥基或羰基取代，CD譜都呈現下列Cotton效應，（290∼295）nm（—），（248∼257）nm（+），（207∼217）nm（—）﹔凡是在[I]式結构中C7為酮基者，則不管3位或15位的取代基如何，都呈現如下Cotton效應﹕（305∼307）nm（—），（272∼278）nm（+），（253∼256）nm（—），（225∼231）nm（+）。
Nishitoba等人在鑒定epoxyganoderiol A的絕對构型時，應用CD譜确定了C24和C25的絕對构型。在epoxyganoderiol A的側鏈上存在著一個環氧基團，為了确定24和25位是S還是R，首先以羊毛甾醇為原料，經反應得到S和R兩种构型的化合物，反應如下﹕
a)AC2O/pyridine, b) SeO2/dioxane, c) NaBH4/CeCl3•7H2O/MeOH-THF
d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH2Cl2
分別將7b和7a溶于CCl4溶液中，加入Eu（fod）3絡合物，測其旋光譜，得到如下結果﹕
以上兩個化合物的CD譜的Cotton效應是与C25的Newman投影相一致的。正Cotton效應為25S負Cotton效應為25R。在相同條件下測epoxyganoderiol A的CD譜，顯示313nm（△ε+10.9）為正Cotton效應，証明25位的絕對构型為S，通過測定NOE，証實24位絕對构型為S。
（三）結构測定中的化學反應
隨著儀器分析新技術、新方法的發展，各類譜學方法和X射線—衍射等分析手段已在結构測定中得到了廣泛的應用。經典的化學方法与儀器分析相結合，使三 化合物的結构測定快速而准确并達到了微量的水平。化學反應常用于証實分子骨架中取代基類型、數目、位置及构型等。
1.氧化反應 氧化反應主要用來确定分子中所含羥基、羰基或 基的數目和位置等。應用較多的是將羥基氧化成羰基，比較常用的是鉻酐— 啶的方法，也有將鉻酐溶于AcOH中攪拌加入樣品中，室溫下攪拌2h，用水稀釋，氯仿提取，提取液經水洗干燥濃縮后經薄層制備而得到氧化產物。
2. 化反應 化反應對于确定分子中羥基的數目、性質、构型很有幫助，常用的乙 化反應，通常采用醋酐— 啶室溫處理的方法。
3.水解 由于部分靈芝三 酸中帶有乙 基，為确定乙 基的存在和數目，采用了水解的方法，如Komoda將ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na2CO3室溫處理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl3萃取，水洗CHCl3液后Na2SO4干燥，蒸干。通過TLC制備得水解產物。
4.還原 還原反應主要用來确定分子中有無不飽和雙鍵及羥基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在确定lucidenato G結构時，為了証實C26位上存在著羥基，先將lucidenate G甲基化，然后再用NaBH4進行還原，得到其丙酮化物，從而証實了C26位存在著一個羥基。
第二節 多糖類化合物
多糖類化合物是靈芝所含化學成分之一，現已証明，靈芝多糖類具有抗腫瘤作用、免疫調節作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故靈芝多糖類是靈芝的主要有效成分。臨床試驗也証實，靈芝多糖可作為腫瘤化學治療和放射治療的有效輔助治療藥。有關靈芝多糖類的分离、純化、結构确証的研究方興未艾，迄今仍為國內外矚目的重要課題。
一、靈芝多糖類的分离、純化及鑒定
靈芝多糖類的分离、純化及結构确証的方法及步驟可概括如下﹕多采用熱水提取、分部沉淀的方式分离靈芝的多糖組分﹔進一步經各种層析如DEAE纖維素柱色譜、Sephadex G75柱色譜，凝膠過濾如Sepharose CL—4B凝膠過濾，高壓電泳和聚丙 胺凝膠電泳等處理可獲純化的多糖﹔后者經酸水解、紙色譜、气相色譜分析可确定其單糖組分，經 水解可檢測殊碳糖（anomeric）結构﹔經甲基化技術及Smith降解、气相色譜、气質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振等可确定多糖的連接方式和基本化學結构。多糖的分子量可通過凝膠柱色譜如SephadeaxG—100柱色譜、超离心測沉降系數等方法測定，一般在測得分子量范圍后，求出平均分子量。
二、靈芝多糖類的理化特性
由于靈芝的种類、產地、分离提取方法各异，所獲靈芝多糖的理化特性、分子量、單糖組分和連接方式不同，生物活性亦有差异。如Hiroshi等（1985）報道，赤芝子實体熱水提取物經濃縮、透析及系列色譜后獲得兩种多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者對小鼠均具降血糖作用。隨后，他們又從赤芝子實体中分离出兩個降血糖有效成分ganoderan B和C，均為糖 ，分子量分別為7 400和5 800。物理化學和化學研究証明，ganoderan B含 喃葡萄糖 基β-1→3主鏈和β-1→6側鏈，ganoderan C則含D- 喃葡萄糖 基β-1→3和β-1→6連接和D- 喃半乳糖 基α-1→6連接。Mizuno等（1986）報告，赤芝子實体經85%乙醇（80℃），熱水（100℃），3%草酸銨（100℃）和5%氫氧化鈉（30℃）提取后，殘渣再用5%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，80℃），20%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，30℃）和5%氯化鋰（溶于二甲醋酸銨中，70℃）提取，獲多糖組分A、B、C。A和B經乙醇分离，醋酸沉淀，Sepharose CL-4B凝膠過濾，得4個β-葡聚糖，其中I和II來自A，III和IV來自B。從C分离出脫乙 殼多糖（chitosan）（V）。I—V經80%甲酸（85℃）處理可獲相應的甲 化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖組成，并具β-（1→3）-D-葡聚糖主鏈和β-（1→6）葡萄糖基側鏈，其分子量分別為330 000、60 000、160 000和110 000。不同之處是IV不含木糖，但含1.2%蛋白質。V經酸水解后，主要含葡萄糖胺，并含少量葡萄糖，經紅外光譜和X射線分析証明為脫乙 殼多糖。給小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I∼IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗腫瘤活性，半數抑瘤量（ID50）分別為42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）報告，赤芝子實体經水提取后，其殘渣經3%草酸銨溶液（100℃）和5%氫氧化鈉溶液（30℃）提取后，得2個水不溶多糖A和B。A經真空濃縮、透析、凍干，Shepharose CL-48凝膠過濾，獲主要組分C。B用醋酸中和至pH5∼6，得酸性异多糖D，加乙醇沉淀得糖蛋白E和另一种异多糖。C由酸性β-D-葡聚糖构成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000∼30 000。D的分离程序同A，它含兩個主要成分G和H，G和H均為酸性异多糖，分別含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000∼100 000。給小鼠腹腔注射A—H對S180均具有抗腫瘤活性，50%抑瘤量為（6.3∼26.3)mg/kg，但口服無效。1989∼1994李榮芷、何云慶等先后報告，赤芝子實体經熱水提取，乙醇分部沉淀、透析、除蛋白等步驟得靈芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。進一步經DEAE纖維素柱色譜分离， 解，酸水解，過碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、气相色譜、高壓液相色譜分析和光譜分析等從BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C中共分离鑒定了18個靈芝多糖均一体，其中5個 多糖、4個葡聚糖，其余為雜多糖，其化學結构及分子量見表6-4。
表6-4 靈芝多糖的化學結构和分子量
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均一体 |
化學結构 |
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分子量 |
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BN3B |
BN3B1 |
β（1→6）β（1→3） |
葡聚糖 |
3.50×104 |
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BN3B2 |
β（1→6）β（1→3） |
阿拉伯半乳聚糖 |
4.00×104 |
|
BN3C |
BN3C1 |
β（1→6）β（1→3） |
葡聚糖 |
1.62×104 |
|
BN3C2 |
β（1→6）β（1→3） |
多糖 |
2.45×104 |
|
GLA |
GLA2 |
|
多糖 |
0.93×104 |
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GLA4 |
均以β（1→3）為主 |
雜多糖 |
1.33×104 |
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GLA6 |
含少量β（1→6）及β（1→4） |
多糖 |
1.28×104 |
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GLA7 |
以半乳糖、葡萄糖為主 |
雜多糖 |
1.20×104 |
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GLA8 |
|
多糖 |
1.48×104 |
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GLB |
GLB2 |
β（1→4）為主，尚有β（1→6） |
葡聚糖 |
0.71×104 |
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GLB3 |
β（1→4）為主，极少β（1→6） |
甘露葡聚糖 |
0.77×104 |
|
GLB4 |
β（1→4） |
雜多糖 |
0.90×104 |
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GLB6 |
β（1→4）含乙 基 |
雜多糖 |
0.88×104 |
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GLB7 |
β（1→4）為主，尚有β（1→6） |
雜多糖 |
0.90×104 |
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GLB9 |
β（1→4）為主 |
半乳葡聚糖 |
0.93×104 |
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GLB10 |
β（1→4）β（1→6）含乙 基 |
雜多糖 |
0.68×104 |
|
GLC |
GLC1 |
β（1→4）少量β（1→6） |
多糖 |
0.57×104 |
|
GLC2 |
β（1→4）少量β（1→6）含乙 基 |
葡聚糖 |
0.60×104 |
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